Cwiczenie 3

Baza danych krystalizacyjnych BMCD, krystalizacja bialek

Zadanie 1. W zestawie krystalizacyjnym Screen 1 (szukaj Screening kits) firmy Hampton Research

http://www.hamptonresearch.com/

wyszukaj warunki, w ktorych czynnikiem stracajacym jest sol (gr.1), glikol polietylenowy PEG (gr. 2) lub 2-metylo-2,4-pentanodiol MPD (gr. 3). Jakie sa ekstremalne wartosci pH testowane tym zestawem?

Zadanie 2. Ze strony www CBB lub bezposrednio:

http://wwwbmcd.nist.gov:8080/bmcd/bmcd.html

polacz sie z baza danych o krystalizacji biomolekul (w NIST National Institute of Standards and Technology w USA) – BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database). Znajdz w niej informacje o krystalizacji lizozymu z jaja gesiego (ang. lysozyme, anser, egg white). Wybierz w tym celu opcje Macromolecules.

Zanotuj warunki krystalizacji oraz odnosnik literaturowy do publikacji, w ktorej po raz pierwszy opisano te krystalizacje. Czy warunki te przypominaja jakis zestaw z kompletu Screen 1 lub Screen 2? Co jest czynnikiem stracajacym? Jaki zastosowano bufor? Jakie bylo pH roztworu krystalizacyjnego? W jakiej temperaturze prowadzono krystalizacje? Jakie bylo stezenie bialka? Jak dlugo rosly krysztaly? Jaka metode krystalizacji zastosowano w tym przypadku?

Zadanie 3. Przeanalizuj symetrie otrzymanych przez autorow krysztalow:

Zadanie 4. Pokaz krystalizacji lizozymu. Sprzet: plytka krystalizacyjna, silikonizowane szkielka nakrywkowe, smar silikonowy do uszczelniania, pipety automatyczne, tipsy. Odczynniki: bialko (lizozym) o stezeniu 20 mg/ml, odpowiedni roztwor buforowy, roztwor soli, odczynnik stracajacy, woda. Krystalizacja bedzie przeprowadzana metoda kropli wiszacej w temperaturze 20° C.

 


Rys.1 Schemat metody kropli wiszacej: 1 silikonizowane szkielko nakrywkowe, 2 roztwor bialka, 3 zbiornik, 4 roztwor czynnika stracajacego, 5 smar silikonowy.


Wlasciwosci krysztalow makromolekularnych

- 30 – 80 % - rozpuszczalnik (“uporzadkowany zel”)

- niewielka liczba bezposrednich oddzialywan miedzy czasteczkami bialka

- obszary i kanaly wodne gwarantuja natywna konformacje bialka, latwa penetracje mniejszych czasteczek

- trwalosc w niewielkim zakresie: pH, temperatury, sily jonowej. Roztwor macierzysty zawsze konieczny

- ograniczony stopien porzadku w sieci

- ograniczony zakres dyfrakcji

- promienie X inicjuja rozklad


Montowanie krysztalu w kapilarze


Krysztaly bialek otrzymane w naszym laboratorium

1. Mutant L-Asparaginazy

2. Forma regularna Ludzkiej Cystatyny C (HCC)

3. Tetragonalna forma cietej HCC

4. Se-Met pochodna HCC

5. Mutant S58A L-Asparaginazy

6. Mutant N248E L-Asparaginazy