Cwiczenie 3
Baza danych krystalizacyjnych BMCD, krystalizacja bialek
Zadanie 1.
W zestawie krystalizacyjnym Screen 1 (szukaj Screening kits) firmy Hampton Researchhttp://www.hamptonresearch.com/
wyszukaj warunki, w ktorych czynnikiem stracajacym jest sol (gr.1), glikol polietylenowy PEG (gr. 2) lub 2-metylo-2,4-pentanodiol MPD (gr. 3). Jakie sa ekstremalne wartosci pH testowane tym zestawem?
Zadanie 2
. Ze strony www CBB lub bezposrednio:http://wwwbmcd.nist.gov:8080/bmcd/bmcd.html
polacz sie z baza danych o krystalizacji biomolekul (w NIST National Institute of Standards and Technology w USA) – BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database). Znajdz w niej informacje o krystalizacji lizozymu z jaja gesiego (ang. lysozyme, anser, egg white). Wybierz w tym celu opcje Macromolecules.
Zanotuj warunki krystalizacji oraz odnosnik literaturowy do publikacji, w ktorej po raz pierwszy opisano te krystalizacje. Czy warunki te przypominaja jakis zestaw z kompletu Screen 1 lub Screen 2? Co jest czynnikiem stracajacym? Jaki zastosowano bufor? Jakie bylo pH roztworu krystalizacyjnego? W jakiej temperaturze prowadzono krystalizacje? Jakie bylo stezenie bialka? Jak dlugo rosly krysztaly? Jaka metode krystalizacji zastosowano w tym przypadku?
Zadanie 3
. Przeanalizuj symetrie otrzymanych przez autorow krysztalow:Zadanie 4.
Pokaz krystalizacji lizozymu. Sprzet: plytka krystalizacyjna, silikonizowane szkielka nakrywkowe, smar silikonowy do uszczelniania, pipety automatyczne, tipsy. Odczynniki: bialko (lizozym) o stezeniu 20 mg/ml, odpowiedni roztwor buforowy, roztwor soli, odczynnik stracajacy, woda. Krystalizacja bedzie przeprowadzana metoda kropli wiszacej w temperaturze 20° C.
Rys.1
Schemat metody kropli wiszacej: 1 silikonizowane szkielko nakrywkowe, 2 roztwor bialka, 3 zbiornik, 4 roztwor czynnika stracajacego, 5 smar silikonowy.Wlasciwosci krysztalow makromolekularnych
- 30 – 80 % - rozpuszczalnik (“uporzadkowany zel”)
- niewielka liczba bezposrednich oddzialywan miedzy czasteczkami bialka
- obszary i kanaly wodne gwarantuja natywna konformacje bialka, latwa penetracje mniejszych czasteczek
- trwalosc w niewielkim zakresie: pH, temperatury, sily jonowej. Roztwor macierzysty zawsze konieczny
- ograniczony stopien porzadku w sieci
- ograniczony zakres dyfrakcji
- promienie X inicjuja rozklad
Montowanie krysztalu w kapilarze
Krysztaly bialek otrzymane w naszym laboratorium
1. Mutant L-Asparaginazy
2. Forma regularna Ludzkiej Cystatyny C (HCC)
3. Tetragonalna forma cietej HCC