?wiczenie 2

Bank struktur makromolekularnych - PDB, oraz baza danych krystalizacyjnych BMCD

Podobnie jak w poprzednim ?wiczeniu uruchom dwa okna zawieraj?ce tekst ?wiczenia i po??czenia do stron internetowych, kt?re wykorzystywa? b?dziesz w ?wiczeniu.


Cel ?wiczenia

Podczas ?wiczenia po??czysz si? z bia?kow? baz? danych PDB (Protein Data Bank), wyszukasz strukture krystaliczna interesujacego Cie bia?ka, wynotujesz zwi?zane z ni? podstawowe informacje krystalograficzne. Nast?pnie po??czysz si? z baz? danych krystalizacyjnych BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database) i wynotujesz warunki krystalizacji dla wybranego przez Ciebie bia?ka. Zbi?r danych okre?laj?cych struktur? jednego z bia?ek zostanie umieszczony w jednym z katalog?w na Twoim koncie, dzi?ki czemu b?dziesz m?g? zbada? struktur? za pomoc? programu graficznego RasMol.


Polecenie 1

W tej czesci ?wiczenia b?dziesz korzysta? z PDB. Baza danych PDB zawiera wyniki bada? strukturalnych ponad 70000 biomoleku?: przede wszystkim bia?ek (92.1%), kwas?w nukleinowych (3.8%), kompleksow bialko-kwas nukleinowy (4.1%) i polisacharyd?w (<0.1%). Struktury biomoleku? przechowywane w PDB zosta?y w przyt?aczaj?cej wi?kszo?ci okre?lone za pomoc? bada? krystalograficznych (84.9%). W ostatnim okresie pojawi?o si? tez nieco struktur okre?lonych metoda j?drowego rezonansu magnetycznego, NMR, (14.6%) oraz mikroskopii elektronowej (0.3%).

Aby dosta? si? do PDB u?yj poni?szego po??czenia:

http://www.rcsb.org/pdb/

Na stronie, kt?ra si? uka?e, w polu PDB ID or keyword (ID=IDentyfikator) wpisz nazwe "swojego" bialka i naci?nij klawisz Search. Pojawi si? strona z wynikami poszukiwa?.

Wyprobuj tez przeszukiwanie zaawansowana (Advanced Search), skladajac zapytanie dwuczesciowe, np. zawierajace nazwe biomolekuly (Macromolecule Name) oraz zakres rozdzielczosci (X-Ray Resolution), np. 1.8-2.2 A.

Aby otrzymac wszystkie wyniki wyszukiwania na jednej stronie, ustaw opcje Results per page. Na li?cie wyszukanych bia?ek zobaczysz symboliczny kod przypisany strukturze w bazie danych, a tak?e nazw? bia?ka, rodzaj techniki u?ytej od okre?lenia struktury, a w przypadku struktur rozwi?zanych krystalograficznie, rozdzielczo?? struktury. Aby uporzadkowac wyniki wyszukiwania wedlug Rozdzielczosci (Resolution), uzyj opcji Sort Results. Za pomoc? myszy wybierz struktur? o najwy?szej rozdzielczo?ci, klikajac na jej ikone. Pojawi si? strona zawieraj?ca skr?towy opis struktury. Wynotuj nast?puj?ce informacje:

?kod w PDB 

?symbol EC, je?li bia?ko jest enzymem 

?krystalograficzny wska?nik rozbie?no?ci R

?rozdzielczosc struktury

?grup? przestrzenna

?parametry kom?rki elementarnej

 

Znajdz teraz w PDB wysokorozdzielcza strukture inhibitora trypsyny z trzustki wolowej (BPTI) o kodzie 1G6X. Zapoznaj sie z narzedziami grafiki interakcyjnej oferowanymi przez PDB. Np. wyprobuj Jmol oraz MBT Protein Workshop. Przetestuj rozne opcje tych programow..

Wroc do strony CBB.  Pod Research  odszukaj i wybierz "Crystal structures solved here", a stad strukture cystatyny C w postaci PDBSummary. Polaczyles sie z serwerem PDBSum European Bioinformatics Institute (EBI). Znajduje sie tu wstepnie przeanalizowana i latwo dostepna informacja o strukturach z banku PDB. Zapoznaj sie ze struktura ludzkiej cystatyny C (kod 1G96). Obejrzyj wykres Ramachandrana dla tej struktury. Jak oceniasz konformacje tego modelu? Przejdz do strony PDB i wyszukaj dane dla zbioru 1G96. Obejrzyj strukture przestrzenna programem RasMol. Jesli system nie potrafi rozpoznac pliku o rozszerzeniu .pdb, wybierz do jego otwarcia program z listy: Internet Explorer. Wyprobuj rozne opcje prezentacji (Display w prawym klawiszu myszy). Znajdz mostki dwusiarczkowe w tej strukturze. Ile ich jest? Ktore reszty spiete sa wiazaniami S-S? Czy konformacja (zwoj bialkowy) tego lancucha wyglada "normalnie"?  Co zwraca Twoja uwage?  Z okienka PDBSum mozesz "sciagnac" inne podobne struktury. Obejrzyj strukture bialka kurzego (1CEW). Czy porownanie tych dwoch struktur nasuwa Ci pomysl, dlaczego konformacja lancucha bialka ludzkiego wygladala "dziwnie"?


Uwaga
W aktualnej wersji programu RasMol
moga nie dzialac niektore opcje
Przepraszamy za utrudnienia i liczymy na wyrozumialosc


 

Polecenie 2

Po??cz si? z baz? danych BMCD. Aby to zrobi? cofnij si? u?ywaj?c przycisku Wstecz (lub Back) do tekstu ?wiczenia i wybierz poni?szy adres:

http://xpdb.nist.gov:8060/BMCD4/index.faces

Po??czy?e? si? z baz? danych o krystalizacji biomoleku? BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database) w NIST (National Institute of Standards and Technology) w USA. W bazie tej przechowywane s? informacje o warunkach krystalizacji makrocz?steczek biologicznych. Krystalizacja jest pierwszym i trudnym etapem w pracy krystalografa. Od jego powodzenia zale?y sukces ca?ego procesu okre?lania struktury bia?ka. Je?li bia?ko nie tworzy kryszta??w, niemo?liwe jest okre?lenie jego struktury metodami rentgenowskimi. Dlatego tak wa?ne jest gromadzenie informacji o warunkach krystalizacji bia?ek. Cz?sto podobne bia?ka (np. mutanty) mog? by? krystalizowane w bardzo podobnych warunkach.

W polu wyszukiwarki wpisz nazwe "Twojego" bialka. Jesli przegladarka znajdzie wiecej odnosnikow, wybierz te krystalizacje, ktora Cie najbardziej interesuje. Na nowej stronie znajdziesz krotki opis bia?ka i jego krysztalow oraz informacje o warunkach krystalizacji. Nast?pnie wynotuj:

?st??enie bia?ka 

?sk?ad roztworu rezerwuarowego 

?sk?ad roztworu bia?ka

?czas wzrostu kryszta?u


Polecenie 3

Teraz zajmiesz si? badaniem pewnych w?a?ciwo?ci strukturalnych kompleksu bia?ka (w tym przypadku bia?ka regulatorowego Cro) z kr?tkim fragmentem DNA. Celem ?wiczenia jest odpowied? na pytanie, jaki rodzaj oddzia?ywa? odpowiedzialny jest za ??czenie si? bia?ka Cro z cz?steczkami DNA. Aby odpowiedzie? na to pytanie wykonaj poni?sze polecenia.

Jedno okno przegl?darki s?u?y? Ci b?dzie do czytania polece?, w drugim po??czysz si? ze stron? zawieraj?c? struktur?. Struktura zdeponowana jest w banku PDB z kodem 3CRO. Wyswietl te strukture za pomoca programu RasMol. Przed Tob? powinna pojawi? si? struktura kompleksu bia?ka Cro z fragmentem DNA. Struktura ta pojawi?a si? w postaci Wireframe (patrz - s?owniczek na ko?cu ?wiczenia), czyli modelu drutowego - poszczeg?lne punkty odpowiadaj?ce atomom niewodorowym w strukturze po??czone s? patyczkami. U?ywaj?c myszy i klawiatury mo?esz pomniejsza? lub powi?ksza? obraz, obraca? go w zadany spos?b itp. Przyci?nij lewy klawisz myszy i obracaj struktur? w okienku. Aby zmniejszy? lub powi?kszy? obraz naciskaj klawisz Shift i jednoczesnie poruszaj mysza naciskaj?c jej lewy przycisk. Prawy przycisk myszy i klawisz Ctrl umozliwiaja przesuwanie obrazu w plaszczyznie ekranu. Prawy przycisk i Shift powoduje obrot wokol osi prostopadlej do ekranu. Aby zmieni? wygl?d obrazka wybierz z g?rnej listwy polecenie Display i sprawdzaj kolejne opcje. Jesli uzywana wersja programu RasMol nie posiada listwy opcji, mozesz je wyswietlic naciskajac prawy klawisz myszy. Sprobuj eksperymentowac z kolorami u?ywaj?c opcji Colours. Gdy ju? zapoznasz si? z podstawowymi mo?liwo?ciami graficznymi programu wykonaj nast?puj?ce zadania:

?jakie dwa typy makrocz?steczek wy?wietli?e?? Aby lepiej obserwowa? DNA, naci?nij w oknie zawieraj?cym cz?steczk? prawy klawisz myszy, z ukazuj?cego si? menu wybierz polecenie Select a nast?pnie polecenie Nucleic i raz jeszcze Nucleic. Potem naci?nij prawy klawisz myszy i wybierz sekwencje polece?: Select, Hide, Hide not Selected. Raz jeszcze naci?nij prawy klawisz myszy i wybierz polecenie Display, a nast?pnie Ball & Stick. 

?Jak? skr?tno?? ma podw?jna helisa DNA? Aby zobaczy? jak poszczeg?lne zasady ??cz? si? ze sob? w pary, przyciskaj?c prawy klawisz myszy wykonaj nast?puj?ce polecenia:

oselect nast?pnie nucleic a potem purine

oselect a potem change color to nast?pnie green

oselect nast?pnie nucleic a potem pyrimidyne

oselecta potem change color to nast?pnie purple

Jakie zasady ??cza si? w pary? Mo?esz to sprawdzi? wykonuj?c:

oselect nast?pnie nucleic a potem AT

oselect a potem change color to nast?pnie white

oselect nast?pnie nucleic a potem CG

oselect a potem change color to nast?pnie red

Aby przedstawi? pe?n? struktur? DNA wykonaj nast?puj?ce polecenia:

oselect nast?pnie nucleic a potem backbone

oselect a potem change color to nast?pnie Orange

Pokolorowa?e? w ten spos?b szkielet fosforanowo-cukrowy na pomara?czowo, natomiast zasady pozosta?y bez zmian. Jaki rodzaj ugrupowa? chemicznych wchodz?cych w sk?ad helisy znajduje si? na zewn?trz ?a?cucha DNA? Aby lepiej to obserwowa? wykonaj nast?puj?ce polecenia:

Select a nast?pnie polecenie Nucleic i raz jeszcze Nucleic. Potem naci?nij prawy klawisz myszy i wybierz sekwencje polece?: Select, Hide, Hide not Selected. Raz jeszcze naci?nij prawy klawisz myszy i wybierz polecenie Display, a nast?pnie Spacefill, Van der Waals Radii.

Jakie elementy struktury DNA wy?cie?aj? bruzd? wi?ksz? a jakie mniejsz??

Aby lepiej zilustrowa? po??czenia mi?dzy zasadami u?ywaj?c opcji Display zmie? spos?b przedstawienia DNA na Wireframe, powi?ksz nieco obraz i wybierz polecenie Options a nast?pnie Display Hydrogen Bonds. Wybierz r?wnie? Select, Click Mouse Action i Distance.

Ile para zasad przypada na pe?en zw?j podw?jnej helisy? Jaka form? (A, B, Z?) ma podw?jna helisa DNA w analizowanej strukturze?

Ile wi?za? wodorowych ??czy zasady w parach A-T, a ile w parach C-G?

Okre?l atomy donor?w i akceptor?w oraz d?ugo?ci tych wi?za? wodorowych (Donor .... Akceptor)? (D?ugo?? wi?zania mi?dzy dwoma atomami b?dzie si? pojawia?a na dolnej listwie przegl?darki, gdy wybierzesz prawym klawiszem myszy ka?dy z nich). Aby u?atwi? sobie wykonanie ostatniego polecenia wybierz z menu Display opcj? Ball & Stick.

Zbadaj teraz struktur? dimeru bia?ka Cro . W tym celu wykonaj nast?puj?ce polecenia:

Wy??cz opcj? Display Hydrogen Bonds (menu Options)

Wykonaj sekwencj? polece?: Select, Protein, Protein

Nast?pnie Select, Hide, Hide not Selected (wszystko zniknie), a potem

Wybierz opcj? Display, Backbone

Jakie elementy struktury drugorz?dowej potrafisz odnale?? w strukturze tego bia?ka?

Jakie motywy struktury naddrugorz?dowej zauwa?y?e??

Jaka jest struktura czwartorz?dowa tego bia?ka?

Powi?ksz nieco dowolny fragment bia?ka. Z menu Display wybierz opcje Ball & Stick. Sprawd? d?ugo?ci nast?puj?cych wi?za?:

- peptydowego

- Calfa - C

- N-Calfa

- C-O

- wi?zania wodorowego w helisie, w p?tli, miedzy ?a?cuchami bocznymi aminokwas?w

Aby zaznaczy? wi?zania wodorowe wybierz sekwencje polece?: Options, Display Hydrogen Bonds. Zapisz d?ugo?ci poszczeg?lnych wi?za?. W jakim zakresie odleg?o?ci mieszcz? si? d?ugo?ci wi?za? wodorowych, kt?re wybra?e? do pomiaru?

Zbadasz teraz wzajemne oddzialywania bialka z DNA. W tym celu wykonaj nast?puj?ce polecenia:

Najpierw pomniejsz cz?steczk? bia?ka

1.Select, Select All

2.Color, Monochrome

3.Display, Wireframe

4.Options, Display Hydrogen Bonds (w??cz je)

Jakie ?a?cuchy boczne bia?ka najcz??ciej penetruj? bruzdy podw?jnej helisy DNA?
Jakie oddzia?ywania z cz?steczk? (polianionem) DNA s? w ich przypadku najbardziej prawdopodobne?
Czy s? jakie? wi?zania wodorowe pomi?dzy bia?kiem a DNA?

Wykonaj nast?puj?ce polecenia:

1.Select, Hetero, Hetero

2.Display, Ball & Stick

Zaznaczy?e? w ten spos?b cz?steczki wody obecne w strukturze kompleksu Cro-DNA. Czy s? jakie? cz?steczki wody pomi?dzy bia?kiem a DNA? Zmierz odleg?o?ci pomi?dzy cz?steczkami wody a atomami DNA lub bia?ka.

Aby lepiej zilustrowa? charakter oddzia?ywa? bia?ko-DNA wykonaj:

1.Select, Protein, Protein

2.Display, Cartoons

3.Select, Change Color To, Red

4.Select, Nucleic, Nucleic

5.Display, Spacefill, van der Waals Radii

6.Select, Change Color To, White

Powi?ksz rysunek i analizuj jego fragmenty. Widzisz teraz na jakiej zasadzie bia?ko wi??e si? z DNA. Wnioski wpisz do zbioru z wynikami.


S?owniczek polece? 

backbone - przedstawia makrocz?steczk? w formie po??czonych ze sob? atom?w Calfa

Ball & Stick - przedstawia makrocz?steczk? w formie modelu kulkowo-patyczkowego (atomy reprezentowane s? przez kulki, wi?zania miedzy nimi przez patyczki)

Sticks - model szkieletowy; przedstawiony za pomoca wiazan

select - umo?liwia wybranie pewnej cz??ci cz?steczki (pozosta?e s? widoczne)

spacefill - przedstawia makrocz?steczk? w formie modelu czaszowego (zwanego tez CPK od nazwisk Corey-Pauling-Koltun), w kt?rym atomy przedstawione s? za pomoc? swych sfer van der Waalsa w kolorach C=szary, N=niebieski, O=czerwony, S=zolty.

wireframe - przedstawia makrocz?steczk? w formie modelu drutowego, w kt?rym widoczne s? wi?zania pomi?dzy punktami odpowiadaj?cymi poszczeg?lnym atomom.