Ćwiczenie 3

Wykorzystanie danych krystalograficznych i grafiki komputerowej (KINEMAGE) do analizy struktury makromolekuł


Cel ćwiczenia

W ćwiczeniu analizujemy struktury białek określone metodami krystalograficznymi i zdeponowane w banku danych białkowych PDB (Protein Data Bank). Wykorzystujemy w tym celu technikę komputerowa zwana kinemage, czyli technikę obrazów kinetycznych (OK). Jest to narzędzie używane przez naukowców wykorzystujące możliwości interakcyjnej grafiki komputerowej. 


Polecenie 1

W tym ćwiczeniu uruchomisz program Kinemage (Mage) aby za pomoca techniki kinemage przeanalizowac konformacje centrum aktywnego Karboksypeptydazy A oraz jego ruch w trakcie wiazania substratu.

Korzystając z umiejętności zdobytych w poprzednim ćwiczeniu, połącz się z bankiem struktur białkowych (PDB).

Wybierz Advanced search
W okienku Choose a Query Type wybierz Macromolecule Name i wpisz carboxypeptidase A.
Nacisnij Submit Query
Dostosuj Results per page
Uszereguj struktury wedlug rozdzielczosci i wybierz te o najwyzszej rozdzielczosci

Obejrzyj te strukture naciskajac jej kod PDB. Pojawi się strona zawierająca dane dotyczące białka.
Klikajac na ikone tekstu obok kodu PDB po prawej stronie (Display file -> PDB file) uzyskujesz wglad w oryginalny zapis PDB.
Szczegolowe informacje o strukturze i jej wyznaczeniu uzyskasz w formie uporzadkowanej wybierajac zakladke Methods lub Geometry.
Wykorzystując wiedze zdobyta w poprzednich ćwiczeniach wynotuj następujące informacje:

-         autora lub autorów odkrycia

-         rok odkrycia

-         odnośniki do literatury opisującej odkryta strukturę

-         rozdzielczośćokreslonej struktury

-         parametry charakteryzujące jakość modelu struktury - RMSD dla długości wiązań

-         kod w PDB

-         krystalograficzne wskaźniki rozbieżności R-Value i R-Free

-         symbol EC

-         grupę przestrzenną

-         parametry komórki elementarnej


Polecenie 2

Uruchom program Mage. Pojawia sie trzy okna jednoczesnie:

W okienku File-Open File mozesz wybrac kilka zestawow obrazow kinetycznych OK. Na poczatek wybierz kin.kin. W zestawie tym jest kilka OK. OK_1 pojawia sie automatycznie. Jest to animowana reprezentacja zmian konformacyjnych karboksypeptydazy A zachodzacych podczas wiazania substratu, ktorym jest dipeptyd glicylotyrozyna (Gly-Tyr). Ilustracje wykorzystuja dane strukturalne (w obrebie centrum aktywnego) zdeponowane w PDB przez Christiansona i Lipscomba oraz przez Reesa i wsp.

Polski opis sposobu postepowania w tej czesci cwiczenia podany jest ponizej.

Większość funkcji oferowanych przez OK jest zrozumiała sama przez się. Zapoznaj się z nimi posługując się myszą i własna wyobraźnia. Na pierwszy plan ekranu możesz wprowadzić okienko tekstowe, graficzne lub z krótkim komentarzem przez klikniecie myszą w odpowiednim obszarze. Wielkość i położenie okienek mogą być modyfikowane zgodnie z regułami systemów okienkowych. Okienka z tekstem mogą być "przewijane". Inny OK z danego zestawu otworzysz naciskając przycisk Kinemage a następnie wybierając Next lub podając liczbę.

 Ruchy myszy powodują rotacje obrazu: przeciąganie kursora w poprzek górnej części ekranu graficznego powoduje obrót wokół osi Z (w płaszczyźnie ekranu). Przeciąganie kursora w innych częściach ekranu powoduje obroty wokół osi X, Y lub ich kombinacje. Glebie pola widzenia uzyskano zmieniając intensywności barwy.

Aby wrócić do widoku początkowego, naciśnij Views i wybierz View1. Dany OK może być przedstawiony nawet w 60 rzutach. Użytkownik może dobrać sobie najbardziej odpowiadający mu rzut, zapamiętać go przy pomocy Set Reader's View, a następnie wrócić do niego wybierajac Reader's View.

 Aby uzyskać Animacje struktury karboksypeptydazy naciskaj raz za razem przycisk animate w okienku graficznym. Z pewnością zauważyłeś ogromne zmiany polegające na:

(1) pojawieniu się substratu (czerwony dwupeptyd Gly-Tyr) oraz

(2) ruchu Tyr248 (kolor błękitny).

Nie są to jedyne zmiany strukturalne przy przejściu enzymu z formy apo (wolnej) do holo (skompleksowanej); ruch, choć znacznie mniejszy, obserwuje się również w wielu innych fragmentach struktury. Przeprowadź jeszcze raz animacje zmian, ale przy innej orientacji.

 Wypróbuj funkcje TURN ON i OFF (wyłącznik) dla rożnych grup naciskając odpowiednie przyciski w okienku graficznym. Włącz obie formy przez "zaznaczenie" 3cpa-GY oraz 5cpa-apo. Teraz wyłącz Tyr248 w obu formach. Wyłącz również Gly-Tyr i łańcuch główny (main chain) i przeprowadź ponownie animacje obserwując ruchy innych łańcuchów bocznych. Powtórz animacje mając na ekranie jedynie łańcuch główny- main ch i atom Zn, aby zaobserwować subtelne zmiany w przebiegu łańcucha głównego.

 Grupa static obejmuje obiekty niezmienne podczas animacji: szara kulke oznaczająca Zn oraz etykiety. Przełącz kilka razy grupę static oraz jej składniki, aby zrozumieć logikę tych przycisków: dany obiekt może być włączony zarówno przy pomocy swojego przycisku, jak i przycisku grupowego wyższego ranga.

Wyprobuj funkcje Informacyjne. Włącz znaczniki (markers). Wybierz atom: jego położenie zaznaczy jeden z dwóch markerów oraz pojawi się komentarz dotyczący wybranego atomu. Wybierz kolejny atom: w jego miejscu pojawi się drugi znacznik, wyświetlony zostanie komentarz oraz odległość pomiędzy zaznaczonymi atomami. Komentarz i informacja o odległości funkcjonują również bez znaczników, ale jest wówczas trudniej śledzić wybierane atomy. Mierzyć można odległości miedzy różnymi atomami lub miedzy tym samym atomem w rożnych konformacjach.

 Otwórz menu Display (lub Options). One width pozwala na przełączanie pomiędzy linia o jednakowej grubości a linia zwężająca się w głąb. Thin line rysuje najcieńsza z możliwych na danym ekranie linii. Perspective pomniejsza obiekt w miarę wzrostu odległości od widza.

W okienku Display jest rowniez opcja Stereo on.

 W okienku Tools (lub Others) znajdziesz m.in. opcje measures, XYZ point (wyświetlanie współrzędnych x,y,z wybranego ostatnio punktu) oraz Gnomon (znaczek reprezentujący położenie osi współrzędnych). W innej wersji programu Mage niektore z tych opcji dostepne sa jako Kludges.


Polecenie 3

Pytania:

  1. Scharakteryzuj krotko działanie karboksypeptydazy A.
  2. Kto odkrył strukturę karboksypeptydazy A?
  3. Zmierz długości wiązań, kąty walencyjne oraz kąty torsyjne we fragmencie Y240-G253 łańcucha głównego formy apo (bez liganda) lub holo (z ligendem) karboksypeptydazy A. Aby ułatwić sobie zadanie skorzystaj z wzorca tabeli (cw3-tab) znajdujacego sie na dysku krystal. Rozpocznij teraz "wędrówkę" wzdłuż łańcucha wybierając atom po atomie, przy włączonej funkcji measures z menu Tools. Wyłącz wszystkie opcje Tyr248, other sc, GlyTyr. U dołu okna graficznego pojawiały się będą kolejno:

długość wiązania dla dwóch ostatnio zaznaczonych atomów

kąt walencyjny zdefiniowany przez trzy ostatnio zaznaczone atomy

kat torsyjny zdefiniowany przez cztery ostatnio zaznaczone atomy.

Dla przykładu w tabeli podano już pierwsze wyniki. Sprawdź je i wypełnij cala tabel w analogiczny sposób. Co trzeci kat torsyjny powinien być plaski (omega około 180 stopni).

  1. Odpowiadajace sobie pary katow phi,psi nanies na Wykres Ramachandrana. Jaka strukture drugorzedowa sugeruja pary phi,psi?
  2. Zmierz wielkość przesunięcia atomu OH Tyr248 w karboksypeptydazie A w trakcie wiązania substratu.
  3. Znajdz najblizszych sasiadow jonu Zn w karboksypeptydazie A oraz ich odleglosci do tego jonu. Jakie to sa wiazania?