Cwiczenie 4

Wykorzystanie danych krystalograficznych i grafiki komputerowej (KINEMAGE) do analizy struktury anhydrazy weglanowej

Cel cwiczenia

W cwiczeniu analizujemy struktury bialek okreslone metodami krystalograficznymi i zdeponowane w banku danych bialkowych PDB (Protein Data Bank). Wykorzystujemy w tym celu technike komputerowa zwana kinemage, czyli technike obrazow kinetycznych (OK). Jest to narzedzie uzywane przez naukowcow wykorzystujace mozliwosci interakcyjnej grafiki komputerowej. 

Polecenie 1

W tej czesci cwiczenia uruchomisz program Kinemage (Mage) by przeanalizowac technika kinemage centrum katalityczne anhydrazy weglanowej II.

W okienku File-Open Filewybierz znany Ci juz plik kin.kin. W zestawie tym jest kilka OK. (OK_1 pojawia sie automatycznie; jest to znana Ci juz animowana reprezentacja zmian konformacyjnych zachodzacych w cebntrum aktywnym karboksypeptydazy A podczas wiazania substratu.)

OK_2 (wybierz 2 w okienku Kinemage--Choose) pokazuje lancuch Calfa ludzkiej anhydrazy weglanowej II, zaznacza w centrum aktywnym jon cynku (Zn) wraz z jego ligandami (kolor niebieski) oraz petle (kolor bialy), ktorej reszty badano stosujac wyczerpujaca mutageneze. Obroc rysunek by ukaza?c duzy, skrecony arkusz beta, wneke centrum aktywnego oraz polozenie petli.  Wyprobuj funkcje najazdu (Zoom) uzywajac suwaka w prawej czesci ekranu. Ustaw wspolczynnik najazdu na ok. 3 i wybierz opcje stereo z okienka Display. Ekran zostanie podzielony na dwa obrazy: dla lewego i prawego oka. Sprobuj zobaczyc obraz trojwymiarowy. Naciskajac klawisz c mozna uzyskac na przemian obrazy dla patrzenia "rozbieznego" (prawy po prawej, lewy po lewej), lub dla patrzenia zbieznego (obrazy "na krzyz" w stosunku do oczu). Wybierz odpowiednia dla siebie opcje.  Wybierz View4 i zaznacz mutant sc (lancuchy boczne mutantow). Na przemian, wylacz i zapal zolty lancuch wegli Calfa, aby ocenic, ktore lancuchy boczne "bialej" petli sa ukryte. Wyprobuj zmiany grubosci wyswietlanej warstwy (zslab). Uzyj rowniez funkcji stereo dla tego rejonu dobierajac zoom dla uzyskania najlepszego efektu. Dla kazdej reszty w petli otrzymano wiele mutantow poznajac w ten sposob role kazdego aminokwasu z tego fragmentu. Ich role mozna podzielic na piec kategorii przedstawionych za pomoca kolorow (Color-keyed) i opisanych etykietami. Reszty fioletowe s? istotne dla procesu zwijania lancucha: sa to glownie pierscienie aromatyczne w obszarze arkusza beta. Reszty zielone wplywaja na szybkosc uwadniania CO2, a zolte wplywaja na pKa. Obie grupy leza blisko centrum aktywnego (z wyjatkiem Glu205). Reszta czerwona odpowiada za trwalosc termiczna: jest to cis prolina 202 na wierzcholku petli. Mutacje szarych aminokwasow nie wywolaly istotnych efektow.

Pytania:

Aby skupic sie na atomie Zn i otaczajacych go tetraedrycznie atomach N, wybierz opcje Pickcenter, kliknij kursorem w miejsce atomu Zn, a nastepnie wylacz przycisk Pickcenter. Pomocne moga byc najazdy i opcja stereo, albo gotowe View3, scentrowane na jonie Zn. Jaka geometrie posiadaja otaczajace jon cynku atomy N histydyn? A jakiej koordynacji oczekiwalbys dla jonu Zn2+? Czy w zwiazku z tym spodziewasz sie dalszych ligandow przy jonie cynku? Zanotuj numery reszt histydynowych koordynujacych jon cynku.

Polecenie 2

W tej czesci cwiczenia zbadamy powyzsze problemy poslugujac sie programem Rasmol i baza danych Protein Data Bank (PDB).
Polacz sie z baza PDB i korzystajac z opcji Advanced Search wyszukaj struktury badanego przez nas enzymu (carbonic anhydrase II). uporzadkuj znalezione struktury anhydrazy weglanowej II wedlug daty zdeponowania w bazie. Czy pierwsza z nich to ta, z ktora pracowales w programie Kinemage? Odszukaj ja poslugujac sie jej kodem (1CA2).
Porownaj charakteryzujace ja parametry doswiadczalne z tymi dla struktury anhydrazy weglanowej II o najwyzszej rozdzielczosci. Wyniki obserwacji bedziesz notowal w koncowej czesci cwiczenia.

Polacz sie z baza PubMed. Jest to najwieksza internetowa biblioteka czasopism z dziedziny nauk biomedycznych udostepniana przez centrum Mb>NCBIM/b> (National Center for Biotechnology Information) w USA. Link do bazy PubMed jest nastepujacy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Odszukaj i zapoznaj sie ze streszczeniem artykulu, w ktorym opisano odkrycie struktury ludzkiej erytrocytarnej anhydrazy weglanowej.

Otworz zbior pdb dla struktury 1CA2 (ikona z "kartka" obok kodu struktury). Usun z niego wszystkie atomy pozostawiajac jedynie: (1) reszty histydynowe koordynujace jon Zn, (2) sam jon Zn, (3) wszystkie czasteczki wody (ile ich jest?). Zapisz zbior wynikowy na swoim dysku (rozszerzenie pdb).

Uruchom program Rasmol i wyswietl swoj okrojony zbior pdb (nazwe wyswietlanego zbioru wybieramy w opcji File). W Display (prawy klawisz myszy) wybierz opcje Ball & Stick. Czy ktoras z czasteczek wody uzupelnia sfere koordynacyjna cynku? Ktora to? Wybierajac opcje Distance (Pick distance), zmierz odleglosc Zn-O. Porownaj ja z odleglosciami Zn-N. Jaki to typ wiazan?
Jakie katy X-Zn-X tworza ligandy w sferze koordynacyjnej cynku? Jaki wieloscian koordynacyjny charakteryzuje jon cynku w strukturze anhydrazy weglanowej II?

Pytania

Zanotuj odpowiedzi na nastepujace pytania:

  1. Scharakteryzuj krotko dzialanie anhydrazy weglanowej.
  2. Jaki jest mechanizm dzialania anhydrazy weglanowej II z erytrocytow?
  3. Symbol EC enzymu.
  4. Kto i kiedy odkryl jej strukture?
  5. Odnosnik do literatury zrodlowej.
  6. Kod w PDB.
  7. Wskaznik rozbieznosci R.
  8. Rozdzielczosc.
  9. Parametry charakteryzujace jakosc stereochemiczna tej struktury, RMSD dla dlugosci wiazan.
  10. Grupa przestrzenna.
  11. Parametry komorki elementarnej.
  12. Odpowiedzi w punktach 6-11 przedstaw dla struktury 1CA2 i dla struktury anhydrazy weglanowej II okreslonej z najwyzsza rozdzielczoscia.

I to by bylo na tyle...
MJ January 17, 2011.