Uwagi,
komentarze, pytania
Analiza konformacyjna modyfikowanych DNA i RNA metodami symulacji dynamiki molekularnej
Streszczenie pracy doktorskiej napisanej w październiku 1999 pod kierunkiem prof. dr hab. Ryszarda W. Adamiaka
Pracownia Chemii Strukturalnej Kwasów Nukleinowych
Instytut
Chemii
Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Noskowskiego 12/14, PL-61-704 Poznań
WSTĘP
W ciągu ostatnich dziesięciu lat modelowanie molekularne stało się
ogólnie przyjętą metodą badawczą w chemii strukturalnej i biologii molekularnej.
Istnieją rozmaite techniki symulacji mające zastosowanie dla obiektów o
różnej wielkości cząsteczki. Pośród nich, metody symulacji dynamiki molekularnej
dowiodły swojej przydatności w opisie struktur biopolimerów, zarówno jako
metoda wspomagająca końcowe etapy prac opartych na metodach spektroskopii
NMR lub krystalografii rentgenowskiej, jak i jako niezależna strategia
analizy konformacyjnej obiektów o niepoznanej dotąd strukturze. Zwłaszcza
w odniesieniu do tego ostatniego podejścia kluczowy jest problem wiarygodności
stosowanych protokołów symulacji oraz reprezentacji modelu.
Celem mojej pracy doktorskiej była wszechstronna analiza konformacyjna
fragmentów RNA oraz DNA zawierających nietypowe elementy strukturalne w
aspekcie ich wpływu na lokalną oraz globalną konformację dupleksu oraz
ocena wpływu różnych strategii komputerowej symulacji dynamiki molekularnej
na szczegóły obrazu strukturalnego badanych modeli.
METODY
Wszystkie symulacje zostały wykonane w polu siłowym
Amber implementowanym
w programach Discover (MSI) i Sander (UCSF). Do budowy modeli strukturalnych
stosowałem procedury dostępne w pakietach programów InsightII (MSI) i AMBER
4.0 (UCSF). Do parametryzacji modyfikowanych nukleozydów używałem programów
Gaussian94 i Resp (UCSF). Eksperymenty obliczeniowe były wykonywane przy
pomocy nowoczesnych strategii symulacji z uwzględnieniem rozpuszczalnika
wodnego, przy czym do opisu oddziaływań elektrostatycznych dalekiego zasięgu
stosowałem zarówno podejście nonbonded cutoff (limit odległości
uwzględnianych oddziaływań) oraz PME (metoda sumowania Ewalda). Czas symulacji
mieścił się między 200 a 1000 ps, zależnie od stopnia skomplikowania modelu.
Symulacje prowadzone były na dwóch komputerach CRAY (YMP-EL i J-916) pracujących
w Poznańskim Centrum Superkomputerowo-Sieciowym (afiliowanym przy naszym
Instytucie). Dalsza analiza konformacyjna trajektorii MD była wykonywana
na komputerach CRAY oraz SGI przy użyciu kilku programów, np. CURVES 5.1
(Lavery & Sklenar), SAHN (program do statystycznej analizy skupień,
którą zastosowałem do oceny wewnętrznej spójności konformacyjnej trajektorii),
jak też moich własnych procedur, z reguły pracujących w środowisku InsightII
np. do opisu oddziaływań warstwowych w obrębie nici kwasów nukleinowych
lub analizy oddziaływań kwas nukleinowy-rozpuszczalnik (woda). Dalsze procedury
tworzyłem dla usprawnionej wizualizacji uzyskanych struktur oraz prezentacji
wyników.
DUPLEKSY DNA ZAWIERAJĄCE 1,N(6)-ETENOADENINĘ
Zbadana została seria dupleksów DNA o długości 11 pz, zawierających
pojedynczą jednostkę 1,N(6)-etenodeoksyadenozyny (edA)
w środkowej parze dupleksu. Wybrałem dwa przypadki, w których obserwowałem
stabilne tworzenie wiązań wodorowych z naprzeciwległą zasadą. W pierwszym
z nich, jedno wiązanie wodorowe było obserwowane w układzie syn-edA
- anti-dC podczas przeważającej części trajektorii. W drugim przypadku
zidentyfikowałem dwa stabilne wiązania wodorowe w układzie syn-edA
i anti-dG, co potwierdzało istniejące dane NMR i krystalograficzne. Dla
tego ostatniego modelu oraz jego niemodyfikowanego analogu (para dC-dG)
wykonałem szczegółowe symulacje MD w roztworze. Stabilność uzyskanych trajektorii
potwierdziła w pełni przewagę podejścia opartego na metodzie PME wobec
metody limitu odległości uwzględnianych oddziaływań. Uzyskane struktury
ukazały zdolność modyfikowanej jednostki do adaptacji do konformacji dupleksu
B-DNA poprzez tworzenie quasi-pary zasad Watsona-Cricka z naprzeciwległą
guanozyną. Analiza trajektorii oparta na metodzie statystycznej analizy
skupień pozwoliła na identyfikację typowych konformacji pary, które dominują
w trajektorii.
a-ANOMERYCZNY NUKLEOZYD W DUPLEKSIE DNA
Niewiele wiadomo na temat wpływu pojedynczego a-nukleozydu
na globalną strukturę dupleksu DNA. Nasze zainteresowanie wzbudziło pytanie,
dlaczego natura "wybrała" tylko b-nukleozydy
jako elementy budulcowe wszystkich znanych kwasów nukleinowych. Wykonałem
serię symulacji dynamiki molekularnej w próżni oraz w roztworze wodnym
w celu przetestowania hipotezy o możliwym zginaniu osi dupleksu pod wpływem
takiej modyfikacji, co sugerowały pewne analizy fizyczne tego typu cząsteczek.
Jednocześnie eksperymenty te pomogły mi w optymalizacji stosowanych protokołów
symulacji. Wstępne symulacje (w próżni oraz z użyciem metody limitu odległości
uwzględnianych oddziaływań) powodowały różnorodne zaburzenia struktury
badanych obiektów (zarówno niemodyfikowanych, jak i zawierających jednostki
a-anomeryczne).
W większości przypadków jednak dupleksy modyfikowane pojedynczym nukleozydem
a-anomerycznym (a-adenozyną
lub a-1,N(6)-etenodeoksyadenozyną) rzeczywiście
wykazywały wyraźne zagięcie osi głównej dupleksu (w porównaniu z niemodyfikowanymi
cząsteczkami referencyjnymi). Tym niemniej, bardziej zaawansowane eksperymenty
z użyciem metody PME nie dawały przekonującego obrazu występowania takiego
efektu. Z drugiej strony dało się zauważyć wyraźną zdolność jednostek a-anomerycznych
do tworzenia par zasad z naprzeciwległymi b-nukleozydami,
które to pary przypominały odpowiednie pary w układach beta-beta, zarówno
dla dA-dT, jak i dla edA-dG.
DUPLEKSY DNA ZAWIERAJĄCE FLUOROFOR LUMINARYNĘ
Przeprowadziłem eksperyment symulacji MD w celu opisu dynamiki konformacyjnej
dupleksu DNA zawierającego pojedynczą jednostkę deoksyluminarozynową (najsilniejszy
z fluoroforów stosowanych w naszym zespole jako sonda konformacyjna w badaniach
strukturalnych). Sugerował on, iż trójpierścieniowy układ luminaryny łatwo
adaptuje się do oddziaływań warstwowych w nici DNA oraz, do pewnego stopnia,
ma możliwość nawiązywania wiązań wodorowych z naprzeciwległą deoksyguanozyną
i tymidyną.
DUPLEKSY RNA ZAWIERAJĄCE WYBRZUSZENIA MODYFIKOWANE 2-AMINOPURYNĄ
W ramach większego projektu mającego na celu opis struktury i dynamiki
krótkich dupleksów RNA zawierających wybrzuszenia purynowe, przeprowadziłem
eksperymenty dynamiki molekularnej w celu symulacji konformacji takich
cząsteczek zawierających jednostki adenozyny i 2-aminopuryny (jej fluoryzującego
izomeru) w regionie wybrzuszenia. Symulacje w roztworze, zarówno metodą
limitu odległości uwzględnianych oddziaływań, jak i PME, dały w wyniku
trajektorie sugerujące znaczny stopień zgięcia dupleksów z wybrzuszeniem,
przy czym jednostki z tego regionu przyjmowały orientacje skierowaną na
zewnątrz (do rozpuszczalnika). Nie zaobserwowano różnic w konformacji systemu
zawierającego 2-aminopurynę w stosunku do układu niemodyfikowanego (wyłącznie
jednostki adenozynowe w wybrzuszeniu). Potwierdza to wcześniejsze wyniki
analiz termodynamicznych wykonane w naszym zespole, a dotyczące własności
2-aminopuryny podstawionej w miejsce adeniny.
TAR RNA HIV-1 I MODYFIKOWANE POCHODNE
Eksperymenty dotyczące TAR RNA wirusa HIV-1 i cząsteczek pochodnych
miały na celu opis dynamiki konformacyjnej regionów niesparowanych tych
modeli. Przeprowadziłem trzy symulacje MD w roztworze wodnym (metodą PME)
dla cząsteczek różniących się sekwencją pętli apikalnej, przy czym współrzędne
wyjściowe pobrałem z PDB (konformacja nr 17 wybrana ze zbioru 1ANR
podanego przez zespół Varaniego). Jeden z modeli miał sekwencję pętli zgodną
z natywnym TAR RNA, a pozostałe były modyfikowane 2-aminopuryną odpowiednio
w pozycjach G34 i A35. Otrzymane trajektorie pomogły opisać dynamikę jednostek
w obrębie pętli i sugerowały że 2-aminopuryna może być podstawiona w miejsce
adeniny, ale już nie guaniny, z niewielkim efektem strukturalnym. W przeciwieństwie
do danych NMR, eksperyment dynamiki molekularnej ukazuje strukturalizację
pętli apikalnej. końcowa konformacja modelu niemodyfikowanego została następnie
zastosowana do eksperymentu mechaniki molekularnej mającego na celu analizę
prawdopodobieństwa wiązania kationu magnezowego w pobliżu trójnukleotydowej
pętli -UCU-. Eksperyment ujawnił dwa miejsca możliwego wiązania Mg2+.
HYDRATACJA RNA
Trajektorie uzyskane z powyżej opisanych eksperymentów (symulacji z
udziałem cząsteczek RNA) zanalizowałem pod kątem identyfikacji specyficznego
wzorca hydratacji, zwłaszcza regionów jednoniciowych. Obliczyłem względne
współczynniki hydratacji poszczególnych atomów, w tym atomów wodoru grup
C-H. Analiza ta została porównana z obserwacjami konformacji regionów niesparowanych,
zwłaszcza w aspekcie tendencji jednostek nukleozydowych do przyjmowania
orientacji w kierunku roztworu bądź wnętrza cząsteczki RNA. Zidentyfikowałem
także pewną liczbę mostków wodnych łączących silnie hydratowane atomy na
powierzchni regionów wybrzuszonych cząsteczek RNA.
WNIOSKI
Zaprezentowane w mojej pracy doktorskiej symulacje dotyczyły szerokiej
gamy problemów, które można efektywnie badać metodami symulacji dynamiki
molekularnej. Szczegółowe wyniki zostały dotąd opublikowane w następujących
artykułach:
1. T. Kulinski, M. Olejniczak, H. Huthoff, L. Bielecki, K. Pachulska-Wieczorek, A. T. Das, B. Berkhout & R. W. Adamiak: The Apical Loop of the HIV-1 TAR RNA Hairpin Is Stabilized by a Cross-loop Base Pair. J. Biol. Chem. (Vol. 278 (40)) 2003, pp. 38892-38901.
2. M. Olejniczak, Z. Gdaniec, A. Fischer, T. Grabarkiewicz, L. Bielecki, R. W. Adamiak: The bulge region of HIV-1 TAR RNA binds metal ions in solution. Nucleic Acids Res. (Vol. 30) 2002, pp. 4241-4249.
3. T. Kulinski, L. Bielecki, R. W. Adamiak: Structure and dynamics of adenosine loops in RNA bulge duplexes as revealed by linked application of thermodynamics, spectrofluorimetry and simulation of molecular dynamics. Nucleic Acids Res. Supplement (No. 1) 2001, pp. 139-140.
4. L. Bielecki, R. W. Adamiak: Structure and dynamics of DNA duplexes containing single a-adenosine residues. Acta Biochimica Polonica (Vol. 48) 2001, pp. 103-111.
5. L. Bielecki, B. Skalski, I. Zagorowska, R. E. Verrall & R. W. Adamiak: Fluorescent a-anomeric 1,N(6)-ethenodeoxyadenosine in DNA duplexes. The a-edA / dG pair. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids (Vol. 19) 2000, pp. 1735-1750.
6. L. Bielecki, T. Kulinski & R. W. Adamiak: Structure and dynamics of adenosine loops in RNA bulge duplexes. RNA hydration at the bulge site. In: RNA Biochemistry and Biotechnology. J. Barciszewski and B. F. C. Clark (eds.), NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers 1999, pp. 73-87.
7. T. Kulinski, L. Bielecki, M. Olejniczak, I. Zagorowska &
R. W. Adamiak: Structure and dynamics of the apical loop region of
29-mer hairpin of the TAR RNA HIV-1 sequence. Collection Symposium
Series (Vol. 2) 1999, pp 191-196.
8. A. Fischer, Z. Gdaniec., M. Olejniczak, L. Bielecki, R. W. Adamiak: Does 29-mer RNA hairpin of the HIV-1 TAR RNA sequence bind magnesium? Nucleic Acids Symposium Series (Vol. 42) 1999, pp. 117-118.
9. T. Kulinski, L. Bielecki, I. Zagorowska & R. W. Adamiak, R. Rigler: Dynamics of RNA bulge duplexes. 2-Aminopurine labelled adenosine loops. Spectroscopy of Biological Molecules: Modern Trends. Annex, 1997 UNED Madrid, Spain, pp. 39-40.
10. T. Kulinski, L. Bielecki, I. Zagorowska & R. W. Adamiak: Introductory data on dynamics of RNA bulge duplexes. 2-Aminopurine labelled adenosine loops. Collect. Czech Chem. Commun. (Vol 61) Special Issue 1996, pp. 265-267.
11. R. W. Adamiak & L. Bielecki: An optimized protocol for in vacuo molecular dynamics simulation and trajectory analysis of modified DNA duplexes. Computational Meth. Sci. Tech. (Vol. 2) 1996, pp. 7-16.
Można też zobaczyć:
Opis kierunków mojej pracy badawczej
